原代肝细胞灌注分离法详细操作步骤

 

　　一、实验准备

 

　　1.动物准备：选择健康成年动物，术前禁食不禁水12至16小时，以减少肝糖原对细胞分离的干扰。

 

　　2.溶液配制：准备灌注缓冲液，通常为无钙Hanks平衡盐溶液或EGTA溶液，用于螯合钙离子，破坏细胞间连接；另配制含胶原酶的消化液，使用含钙的Hanks或WilliamsE培养基作为溶剂，胶原酶浓度根据动物种属和肝健康状况确定，一般范围为0.05%至0.1%。所有溶液需预热至37摄氏度，并调节pH至7.4。

 

　　3.器械与耗材：准备手术剪、镊子、血管夹、静脉留置针、蠕动泵或注射泵、无菌注射器、细胞过滤器（孔径100至200微米）、离心管、培养皿等。

 

　　二、灌注操作步骤

 

　　1.动物麻醉与固定：采用适宜麻醉方法使动物进入深度麻醉状态，仰卧位固定，腹部充分暴露并消毒。

 

　　2.开腹与门静脉插管：沿腹正中线切开皮肤及肌肉，翻开肝脏，暴露门静脉主干。小心分离门静脉周围组织，在远端放置血管夹暂时阻断血流，近端剪一小口，插入留置针并结扎固定，松开血管夹后连接灌注装置。灌注流速根据动物体重调整，通常为5至10毫升每分钟。

 

　　3.预灌注：开启灌注泵，以预热的灌注缓冲液经门静脉冲洗肝脏。同时剪开肝下下腔静脉或胸段下腔静脉作为流出通道。预灌注持续约5至10分钟，直至肝脏颜色由暗红变为土黄，表明血液被清除。

 

　　4.原位消化灌注：关闭流出通道，停止预灌注，转换至胶原酶消化液。继续灌注3至8分钟，期间肝脏会逐渐膨胀、表面出现裂隙或凹陷，质地变软。消化终点可通过轻触肝脏表面出现指压痕或轻轻撕扯肝包膜见肝组织呈絮状判定。灌注时间过长会损伤细胞活力。

 

　　5.肝组织采集与初分散：停止灌注，小心摘取肝脏，放入含预冷终止液（含血清或白蛋白的培养基）的培养皿中。去除胆囊、脂肪及结缔组织，用镊子轻轻撕开肝包膜，用终止液反复吹打或轻摇，使解离的肝细胞释放到悬液中。

 

　　三、细胞纯化与收集

 

　　1.过滤：将细胞悬液经100至200微米细胞过滤器过滤，去除未消化的组织块和血管碎片。

 

　　2.洗涤与离心：滤液以50至100倍重力加速度离心2至5分钟，弃上清。沉淀用预冷培养基重悬，重复洗涤1至2次，每次离心条件相同。

 

　　3.密度梯度纯化（可选）：若需进一步去除死细胞和非实质细胞，可将沉淀重悬后小心铺在密度梯度分离液（如Percoll）上层，以适当转速离心10至15分钟，收集界面处的活肝细胞层。

 

　　4.活力检测与计数：取少量细胞悬液与台盼蓝染液混合，镜下观察，不着色者为活细胞。计数活细胞比例及总细胞数，活细胞比例达到85%以上为合格。

 

　　四、后续处理

 

　　纯化后的原代肝细胞可接种于胶原包被的培养板中，置于二氧化碳培养箱培养，用于后续实验。所有操作应在无菌条件下进行，从动物处死到细胞接种完成控制在30至45分钟内，以最大限度保证细胞活性与功能。